Programme détaillé > Thibault Guinoiseau, Séquençage de fragments longs du virus de l'hépatite C : Développement d'un schéma d'analyse avec Galaxy

Afin d’étudier la diversité virale intra-individuelle du Virus de l’Hépatite C (VHC), il est important d’isoler les variants viraux afin de les séquencer. Une des techniques qui permet de les isoler est l’amplification de génome unique (SGA) ou PCR en dilution limite. Dans les études sur le VHC qui utilisent cette technique, la SGA était suivie d’un séquençage Sanger. L’étude fastidieuse des électrophorégrammes est alors cruciale pour déterminer si l’amplicon est issu d’un génome unique (échantillon clonal) ou non (échantillon non clonal). Pour contourner certaines difficultés du séquençage Sanger, nous avons choisi de séquencer les glycoprotéines d’enveloppe du VHC (E1E2) en séquençage nouvelle génération (NGS) Illumina, grâce au kit Nextera XT (Illumina). Afin de répondre à notre problématique, qui était de distinguer les amplicons issus d’un génome unique, nous avons dû développer un schéma d’analyse des reads spécifique.

Nous avons réalisé l’analyse de nos données de séquençage sur la plate-forme Galaxy Biomina. Après nettoyage des reads et vérification de leur qualité, nous avons réalisé un assemblage de novo avec le logiciel Trinity, puis une analyse de la diversité nucléotidique à chaque position. Des seuils de variabilité nucléotidique ont dû être définis, nous permettant de déclarer que la séquence provenait de l’amplification d’un génome unique ou non. 

Les résultats obtenus par NGS ont été comparé aux performances d’un séquençage Sanger après SGA pour 43 produits de PCR. Les résultats de cette comparaison montrent que le séquençage de fragments longs du VHC par NGS permet de sélectionner avec plus de fiabilité les échantillons clonaux issus de la SGA, du fait notamment de la profondeur importante du séquençage. Ceci est crucial dans l’analyse précise de la diversité virale ainsi que dans la sélection des variants pour des études fonctionnelles.